Artigos & Teses

ESTRUTURA DA GLANDULA PINEAL HUMANA (Tese de Mestrado)

Sérgio Felipe de Oliveira *

Universidade de São Paulo
Estrutura da Glândula Pineal Humana

A Study of human pineal gland structure, using optic microscopy, scanning eletron microscopy, x-ray spectrometry scanning microscopy and x-ray difraction.

Sérgio Felipe de Oliveira - 1.998

"Estudo da Estrutura da Glândula Pineal Humana Empregando Métodos de Microscopia de Luz, Microscopia Eletrônica de Varredura, Microscopia de Varredura por Espectrometria de Raio – X e Difração de Raio – X"

Dissertação apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências. (1.998).

Área de Concentração:

Anatomia Funcional:

Estrutura e ultra-estrutura

Orientador:
Prof. Dr. ESEM PEREIRA CERQUEIRA

Descritores:
1 Glândula Pineal
2 Concreção Calcárea
3 Pinealócito
4 Microscopia Eletrônica
5 Difração de Raio-X
6 Biomineralização ICB/SBIB.052/98
 

RESUMO
Estruturas da glândula pineal humana foram estudadas empregando os métodos de microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura, microscopia de varredura por espectrometria de raio-X e difração de raio-X. As peças para microscopia de luz foram fixadas em solução de formalina a 10% durante 48h. e incluídas em parafina. Para a microscopia eletrônica de varredura, as peças foram fixadas em solução de Karnovsky modificada, sendo que parte das peças foram fraturadas em nitrogênio líquido para o exame das características internas do corpo pineal. Os resultados evidenciaram que o corpo pineal apresenta Formações calcáreas distribuídas no interior do tecido conjuntivo. As formações calcáreas possuem tamanhos e formas diferentes. As estruturas calcáreas apresentam uma cápsula constituída pelo tecido conjuntivo. Na porção interna, a estrutura calcárea é constituída por uma série de lamelas concêntricas, com a porosidade de aspecto amorfo. Evidenciou-se pela análise de difração de raio - x, a estrutura cristalina formada pelos átomos de vários elementos que compõem a formação calcárea.
 

SUMÁRIO

RESUMO

1- INTRODUÇÃO
Anatomia
Aspectos evolutivos e morfofuncionais
Aspectos citológicos e funcionais
Metodos anatômicos de estudo da pineal

2- PROPOSIÇÃO

3- MATERIAL E MÉTODOS
Microscopia de luz
Microscopia eletrônica de varredura
Microanálise e difração de raio-x

4- RESULTADOS
Microscopia de luz
Microscopia eletrônica de varredura com espectrometria de raio - x por dispersão de energia (EDS) Difração de raio-x

5- DISCUSSÃO

6- CONCLUSÕES

7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

8- DEDICATÓRIA
 

ANATOMIA
A glândula pineal humana, segundo ERHART, E.B. (1.962) e MACHADO, A.B.M. (1.983), está localizada na fissura formada pelo encontro do cérebro e dos hemisférios cerebrais, medindo aproximadamente 8 mm de extensão. Ocupa a depressão dos colículos superiores e é inferior ao esplênico do corpo caloso, sendo separado deste pela coroídea do terceiro ventrículo e pelas veias cerebrais nela contidas, estando envolvido pela camada inferior da tela, que então reflete sobre o tecto. A base da pineal é posicionada anteriormente e fixada por um pendúculo dividido anteriormente pela lâmina superior e lâmina inferior, separados pelo recesso pineal do terceiro ventrículo (GRAY'S ANATOMY, 1995); a lâmina inferior contém a comissura posterior e a lâmina superior, a comissura habenular, estruturas componentes da parte não endócrina do epitálamo. Vale ressaltar que a comissura habenular faz parte do sistema límbico, assim como todas as outras extruturas não endócrinas do epitálamo, excetuando a comissura posterior, sendo portanto relacionadas com a regulação do comportamento emocional. O recesso pineal é a área do terceiro ventrículo cerebral onde o pendúculo da pineal se prende, sendo revestido por células ependimárias (BINKLEY, S, 1.998). A pineal juntamente com o órgão subcomissural constitui a parte endócrina do epitálamo, sendo que este, conjuntamente com o tálamo, hipotálamo e subtálamo constituem o diencéfalo. A base do diencéfalo é formada por uma camada de células ependimárias recoberta por mesenquima vascular. A combinação destes dois tecidos origina o plexo coróide do terceiro ventrículo, e a parte mais caudal da base do diencéfalo origina o corpo pineal (SANDLER, T.W., 1996). VOLLRATH, L. (1.981) propôs uma classificação baseada na forma do arranjo do corpo pineal e suas relações com o terceiro ventrículo. São distinguidos os seguintes tipos essenciais: tipo A, quando o corpo pineal esta junto ao terceiro ventrículo; tipo AB quando a pineal é alongada; tipo ABC quando a maior parte da pineal está justaposta ao cerebelo; tipo C quando toda a pineal está na superfície do crânio. Caso a pineal possua duas partes, a menor é representada pela correspondente letra do alfabeto grego. A pineal humana é do tipo A. Quanto a Inervação, ARENDT, J. (1.995) Afirma haver evidências de que a pineal receba multiplos sistemas de inervação, seja de origem exógena, como a inervação simpática periférica, seja direta atravéz do sistema nervoso central, haja visto a detecção de neurotransmissores como o peptídeo intestinal vasoativo, arginina-vasopressina, oxitocina, entre outros. Antigamente pensava-se que as projeções do sistema nervoso central iam até o pendúculo sem atingir a pineal, passando para a comissura posterior, mas a presença dos citados neurotransmissores na glândula evidencia a inervação central. Constituindo-se no nervo do conário, único ou duplo, as fibras nervosas periféricas vêm da região da tenda do cerebelo e penetram nas faces dorsal ou dorso lateral da pineal. Estas fibras periféricas simpáticas são originadas nas células do gânglio cervical superior e correm subendotelialmente na parede do seio reto. Esta via parte da retina ocular e pela projeção retino-hipotalâmica atinge o núcleo paraventricular, sendo que este funciona como uma estação intermediária neste circuito. CIPOLLA NETO, J. (1.996) esclarece que o circuito neuroanatômico responsável pelo controle do metabolismo da glândula pineal segue a seguinte seqüência: retina, via retino - hipotalâmica, núcleo supraquiasmático, núcleo paraventricular hipotalâmico, fascículo prosencefálico medial, medula espinhal torácica alta, gânglio cervical superior, nervos conários e pineal, segundo estudos feitos em roedores. O estudo da estrutura do corpo pineal e aspectos morfofuncionais podem ser melhor esclarecidos a partir da compreensão do desenvolvimento filogenético e ontogenético da glândula pineal, assim como de características citológicas.

Aspectos evolutivos e morfofuncionais
ROMER, A.S. & PARSONS, T.S. (1.977) descrevem a anatomia do epitálamo, em vertebrados inferiores. O teto do terceiro ventrículo é fino em sua maior parte e é uma estrutura não nervosa. Nele desenvolve-se a paráfise, um saco de paredes finas, presente no embrião e ausente no adulto na maioria dos casos, cuja função, do que é conhecido, está ligada à estocagem de glicogêneo, que é enviado ao líquido céfalo-raquidiano. Adjacente à paráfise está a região do plexo coróideo anterior, situado na parte anterior do teto do diencéfalo. Mais para traz, no teto do diencéfalo podem desenvolver-se uma ou duas estruturas medianas pedunculadas, semelhantes a olhos, os órgãos parietal e pineal. Estas estruturas vão formar o olho mediano. Este parece que não é formado sempre a partir da mesma estrutura, mas pode desenvolver-se tanto do órgão parietal (ou órgão parapineal) como do órgão pineal. Ambos podem estar presentes no mesmo animal e, embora adjacentes, são imediatamente distinguíveis pela função de seus pedúnculos. Encontramos olhos medianos bem desenvolvidos somente nas lampreias e alguns lagartos; situados sob a pele, eles podem fazer um pouco mais do que detectar a presença ou ausência de luz, apresentando uma diminuta córnea, cristalino e retina. Estes desapareceram na filogênese, estando ausentes na maioria dos peixes, nos modernos anfíbios, na maior parte dos répteis, em todas as aves e mamíferos. Apesar da perda de função do olho mediano, o órgão pineal persiste nos vertebrados superiores como uma estrutura glandular. No entanto, em alguns vertebrados, como nos tubarões e nas rãs, a pineal embora não se abra na superfície, contém células e ainda atua como um fotoreceptor. Isso já não mais ocorre nos mamíferos. KAPPERS, J.A. (1.971) estuda aspectos evolutivos do órgão pineal. Em peixes e anfíbios o desenvolvimento e estrutura da pineal é, em princípio, semelhante à retina dos olhos, embora com diferenças. Possui células ciliadas, de características neurosensoriais, fotoreceptoras, outros tipos de células nervosas, também sensoriais e tecido conectivo. Em répteis, lacertídeos e tartarugas há uma transformação evolutiva do órgão pineal, com decrécimo da atividade fotoreceptora e neurosensorial, como demonstarm experimentos de eletrofisiologia assim como desorganização ou desintegração do tecido neurosensorial. Em aves, apesar de muitas espécies de pássaros que ainda apresentam uma rudimentar função fotosensória da pineal, os pólos fotoreceptores das células principais já estão ausentes. Vale resaltar, no entanto, que a pineal de aves exerce um papel nos efeitos da luz no sistema reprodutor. Vamos ter, na pineal de aves, uma inervação por fibras noradrenérgicas, à semelhança do que vamos observar e em roedores e mamíferos. Em mamíferos, o órgão pineal não mostra vestígios dos aspectos fotosensoriais, embora remanecentes do aparato ciliar possam eventualmente estar presente, sendo constituído por células específicas, os pinealócitos. Analisando aspectos morfológicos da pineal humana, ERHART, E.A.(1.962), esclarece ser a pineal parte integrante do epitálamo. Há uma variação considerável de um indivíduo para outro, e afirma-se mesmo, "que não existem duas pineais iguais". Rica em vasos sangüineos, é constituída essensialmente por elementos neuro-ectodérmicos, por células da glia e por elementos parenquimatosos diversos. Ressalta a presença, principalmente em indivíduos adultos, das concreções calcáreas denominadas acervuli (areia cerebral). CAJAL, S.R. (1.995) conclui que o desenvolvimento massivo dos plexos nervosos da pineal humana, advindos do gânglio cervical superior "indica inequivocamente que a epífise é pura e simplesmente um órgão endócrino". A glândula pineal é hoje aceita como uma glândula endócrina reguladora da maior importância, modificando a atividade da adenohipófise, neurohipófise, pâncreas endócrino, paratireóide, córtex e medula adrenal e gônadas ( DE VRIES, R.A.C. & KAPPERS, J.A,!.971). GREENSTEIN, B (1.994) ressalta que as funções atualmente estudadas, na qual a pineal está envolvida inclui: efeito antigonadotrófico, mudanças próprias da puberdade, relógio biológico, efeitos de "jet-lag", escurecimento da pele e variações orgânicas sazonais. VOLLRATH, L. (1.981) considera que, o fato do cérebro ser o maior alvo de atuação das substâncias produzidas pela pineal, deve haver uma ligação vascular direta entre a epífise e o cérebro. Um experimento com injeção de corante índia ink em ratos, demostrou que a única ligação vascular entre a pineal e o cérebro é via plexo coróide de ambos os recessos suprapineais e o terceiro ventrículo via veia cerebral magna. Este fato requer uma reversão de fluxo, o que é aparentemente incomum na região da veia cerebral magna. Assim as secreções da pineal alcançam as células alvo via líquido céfalo - raquidiano ( SHERIDAN, M.N. et al, 1.969; KNIGHT, B.K. et al., 1973) ou pela circulação sangüínea. No entanto KAPPERS, J.A. (1.974) esclarece que o recesso pineal é coberto por uma camada de células ependimárias. Entre a camada de células ependimárias do recesso e o parenquina da face dorsal do órgão, existe a pia máter. Evidentemente, ressalta o autor, produtos do parênquima da pineal não alcançam diretamente o líquido céfalo raquidiano que banha o recesso pineal. GARTNER, L.P. & HIATT, J.L. (1.994) sintetiza aspectos estruturais da glândula pineal humana. O tecido conectivo que recobre o corpo pineal é pia máter, a qual envia trabéculas e septos para dentro do parênquima pineal, subdividindo-o em lóbulos incompletos. Vasos sangüineos suprem e drenan elementos do tecido conectivo do corpo pineal. Os principais elementos celulares são pinealócitos e células da glia. Os espaços intercelulares da pineal contém grânulos, calcificados, material conhecido como areia cerebral ou corpora arenacea, "Cujo significado é Deconhecido", ressaltam os autores. A pineal tem um rico suprimento sangüineo, sendo que sua irrigação é derivada da artéria cerebral posterior, que origina as artérias coroidais médio posteriores direita e esquerda e as artérias pineais. Estas ramificações suprem capilares fenestrados. Os capilares drenam em numerosas veias que desembocam na veia cerebral interna ou na veia cerebral magna ( YAMAMOTO, I. & KAGEGAWA, N., 1.980). Quanto a Inervação, vindo do gânglio cervical superior, fibras nervosas autonômicas pós ganglionares, adentram a glândula pineal em associação com artérias que a suprem, ou pelo nervo do conário, ou ainda, pela leptomeninge da superfície da pineal. As fibras nervosas terminam nos espaços perivasculares entre os pinealócitos ou fazem sinapses com estes. Outras fibras nervosas localizadas no pedúnculo podem ser originadas do núcleo da habênula. Os pinealócitos forman o parênquima da pineal; estendendo-se de cada corpo celular, que podem ter núcleos esféricos, ovais ou lobulados, há um ou mais processos basofílicos, tortuosos, contendo microtúbulos ( KNIGHT, B.K. et al. 1.973). Estes processos terminam em botões próximos a capilares, ou menos freqüentemente em células ependimárias do recesso pineal. Estes botões terminais contém retículo endoplasmático rugoso, mitocôndrias e vesículas elétron densas, que estocam monoaminas e hormônios polipeptídicos, cuja secreção parece depender de inervação simpática. Estes elementos são secretados por exocitose, conjuntamente com fragmentos de membranas de vesículas. Estas membranas exocitadas formariam complexos com o cálcio, cuja deposição concêntrica ao redor dos fragmentos destas membranas formariam as conhecidas concreções calcáreas da pineal. ARMSTRONG, S.M. & REDMAN, J.R. (1.993) afirman ser a glândula pineal uma das três áreas anatômicas de localização do sistema circadiano nos vertebrados; assim sendo, temos a pineal, as retinas oculares e o núcleo supraquiasmático. A melatonina é o hormônio efetor do ritmo na organização temporal do corpo, sendo importante para a manutenção dos ritmos infradianos, cicardianos e ultradianos, esclarecem os autores. ZUBAY, G. L. et al. (1.995) acentua que a melatonina, hormônio produzido pela pineal, cuja estrutura química é N- Acetil 5- Metoxitriptamina, tem a função de regulação dos ritmos cicardianos. O âmbito médico, ROBINS, S.L. et al. (1.994) acentua que as lesões clinicamente significativas de pineal são raras, constituindo quase que exclusivamente de tumores. LEWY, A.J. (1.996), ressalta que a pineal está fora da barreira hemato-encefálica. Assim, a produção de melatonina pela pineal humana é deprimida por beta bloqueadores e alfa-2 agonistas. Neurônios pós ganglionares do gânglio cervical superior, noradrenérgicos, estimulam receptores beta-ladrenérgicos dos pinealócitos. Isto resulta em síntese e secreção de melatonina no líquido céfalo-raquidiano e na circulação venosa.

Aspectos Citológicos e Funcionais
KAPPERS, J.A. (1971) ressalta que em pinealócitos adultos botões sinápticos são observados, lembrando o primitivo aparato ciliar. Pinealócitos são neurônios verdadeiros, sendo que as características da pineal são típicas de um órgão endócrino. De acordo com o autor a pineal mostra sinais de funcionmento precocemente na vida pré natal, devido à ependimosecreção no sistema ventricular. As células comissurais aparecem a partir de células ependimárias constituindo o lobo posterior da pineal. A produção secretória destas células é jogada na circulação sangüínea e não no terceiro ventrículo. A camada ependimária prolifera e forma pseudofolículos, cuja luz não tem comunicação com o ventrículo cerebral. Estes folículos desaparecem em estágios mais avançados do desenvolvimento embrionário. Durante o desenvolvimento embrionário o corpo pineal é invadido por tecido conjuntivo derivado da pia - máter que forma a cápsula do órgão e penetra no seu interior formando septos. A estrutura da pineal é, pois, complexa devido à existência de elementos mesodérmicos derivados da pia-máter e elementos derivados do epêndima, ou seja, neuroectodérmicos. Diversos autores atribuem um envolvimento complexo de todas estas estruturas, parenquimatosas e de tecido conectivo, na gênese das concreções calcáreas da pineal. KITAY, J. &ALTSCHULE,M.(1.954) apud BINKLEY, S. (1.988) consideram que a ocorrência de calcificação em pineal humana segue a seguinte proporção: despresível no primeiro ano de vida; cerca de 25% na segunda década, havendo um incremento gradual da terceira para a oitava década de vida. Também colocam estes autores que nenhuma relação está estabelecida entre a ocorrência de calcificação e estágios funcionais da glândula pineal humana. ANGERVALL, L. et al. (1.958) identificaram como hidroxiapatita a fase mineral presente na glândula pineal, num estudo com difração de raio-x. Estes autores fizeram um estudo difratográfico comparativo de diversos processos de calcificação, abrangendo esmalte e cemento dentário, calcificações tumorais intracranianas, calcificações arteriais e de linfodonos, além das concreções calcáreas em pineal humana. Observou-se um grau de cristalinidade menor em pineal e outros tecidos, comparativamente ao esmalte e cemento dentários, apesar da mesma composição de hidroxiapatita. O que faz a diferença nestes casos é o arranjo cristalino. EARLE, K.M. (1.965) observou que as concreções calcáreas em pineal são constituídas por agregação de pequenos cristais em forma de agulha, evidenciando por difração de raio-x que a constituição destes é característico dos padrões de hidroxiapatita. MABIE, C. T. & WALLACE, B. M. (1.974) estudaram as calcificações em pineal humana por diversos métodos, quais sejam, a microscopia ótica, microscopia eletrônica de varredura e de transmissão, difração de raio-x, e análises químicas, corroborando os achados que evidenciam a composição de hidroxiapatia das concreções calcáreas da pineal, demonstrando as características camadas concêntricas, observáveis também a microscopia ótica. O autor demonstra que as concreções podem ser mononucleadas ou multinucleadas, sendo que em humanos são mais comumente multinucleadas. JAPHA, J.L. et al. (1.976) estudaram calcificações em superfície de glândula pineal de gerbil (Meriones unguiculatus), observando que há similaridades no processo de calcificação neste animal e na pineal humana, sugerindo que o gerbil possa ser o modelo experimental ideal para estudos do fenômeno de calcificação da pineal. Estes autores observam que as inclusões calcáreas localizam-se nas porções superficiais da pineal, estando ausentes na pineal profunda. Estudando a composição orgânica das concreções da pineal de gerbil, demonstraram a presença de carbohidratos, pela reação PAS-positivo, assim assim como as proteínas, pela digestão por tripsina. As reações com alcian blue, neste trabalho indicaram que a estrutura de carbohidrato é um ácido mucopolissacarídeo. A presença de lípides na matriz orgânica das concreções foi demonstrada pelo método de sudan black. JAPHA, J.L. et al. (1.976) ressaltam interessantes resultados que indicam o envolvimento da glândula pineal no metabolismo de cálcio ( MENIGOT, M. et al., (1.970) e podendo ter relação funcional com a glândula paratireóide ( KISS, J. et al., 1.969; REITER, R. J. et al., 1.973). MOLLER, M. et al, (1.979) estudaram calcificações em tumores de pineal humana, utilizando técnicas de microscopia eletrônica e difração de raio-x, evidenciando que estes tipos de calcificação são de padrão amorfo, diferindo da calcificação normal presente nas calcosferitas de pineal, que caracterizam-se pelo padrão de arranjo cristalino da hidroxiapatita. BINKLEY, S. (1.988) ressalta que a estrutura da pineal humana é caracterizada pela presença de muitas inclusões calcáreas. Em importante publicação, este autor acentua aspectos relevantes: quanto ao desenvolvimento de concreções calcáreas, há relatos da presença destas estruturas já dos 1 a 3 anos de idade, sendo que é alta incidência em humanos; as concreções têm um formato curioso de amora e são compostas por hidroxiapatita e traços de elementos como magnésio e estrôncio, comparável à composição do esmalte dentário; o grau de calcificação da pineal aumenta com a idade. SCHMID, H.A. & RAYKHTSAUM, G. (1.995) realizaram importante trabalho com pineais humanas de homens de 14, 47, 62, 82 anos, procurando relacionar alterações estruturais das concreções calcáreas de pineal com o envelhecimento. Ultilizaram microscopia eletrônica de varredura e espectrometria de raio-X . Baseados em cortes seriados de uma mesma concreção, com intervalos de 20 micrômetros e utilizando reconstrução estereológica, ficou evidenciada a estrutura de lamelas concêntricas em forma de anéis. O número de lamelas concêntricas aumentam com a idade. Gradualmente, conforme aumenta o número de lamelas, estas se tornam mais estreitas e tendem a sofrer ondulações que dão um aspecto de zig-zag. Evidenciam-se diversas formas evolutivas, a começar por concreções de morfologia esférica, evoluindo até a forma de amora, devido à agregação de unidades, com proporções que vão de 30 a 100 micrômetros. Tais resultados são discutidos no trabalho quanto suas implicações funcionais, dentre as quais ressaltamos alguns aspectos discutidos por estes autores. A estrutura orgânica das concreções da pineal contêm índoles, proteoglicanas e glicoproteínas ( PALLADINI, G. et al., 1.965; LUKASZYK, A. & REITER, R. J., 1.975) assim como carbohidratos e ácidos mucopolissacarídeos (JAPHA, J. L. et al., 1.976). Este fato, tomando juntamente com a composição predominante de cálcio-hidroxiapatita (AGERVALL, L. et al, 1.958; EARLE, K. N., 1.965; KRSTIC, R., 1.986), aponta para uma relação patológica ou fisiológica entre a biossíntese de melatonina, as etapas bioquímicas cálcio dependentes ( MORTON, D.J. & REITER, R. J., 1.991) e o estoma matricial da glândula pineal. A biomineralização é a manifestação físico-química da programação genética do envelhecimento do tecido pineal humano KLOEDEN, P. E., 1.990). Muitos sustentam que a mineralização reflete o envelhecimento e alterações sequelares de processos patológicos. SCHMID, H. A. & RAYKHTSAUM, G. (1.995), baseado em resultados experimentais que demonstram alterações na composição de cálcio e fósforo, dentro de uma mesma concreção, assim como variações características conforme a idade, coloca que estas mudanças representam processos de remodelação da estrutura mineralógica dentro da mesma calcificação ao longo da vida. Sustentam estes autores, que a calcificação da pineal é uma expressão da distrofia celular e está primária ou secundariamente associada ao processo de envelhecimento. O arranjo molecular envolvido com a biomineralização tem sido estudado em várias estruturas ( conchas, dentina, ossos). A mineralização inicia-se intracelularmente a partir de vesículas de gordura guiada e influenciada pelo citoesqueleto, assim como, extracelularmente pelas fibras colágenas. Estas estruturas organizam a fase inorgânica numa geometria precisa-lamelar, colunar ou reticular; no entanto muitos passos destas construções são ainda desconhecidos (MANN, S., 1.993). Distrofia de células da pineal secundárias à deposição de cálcio nunca foi diretamente demonstrado. Observação de um incremento das concreções em vacúolos de pinealócios de gerbil sugerem fortemente que células em estado hipersecretório precedem transformações distróficas ( JAPHA, L. et al., 1.976; LUKASZYK, A. & REITER, R. J., 1.975; WELSH, M.G. & REITER, R. J., 1.978). A formação das concreções clacáreas deve se dar secundariamente a estados celulares hipersecretórios, considerando-se que a porção orgânica das concreções contém índoles. O núcleo inorgânico de carbonato de cálcio e hidroxiapatita é semelhante à dentina nas proporções cristalinas e nos padrões de difração de raio-x. Considerando as múltiplas similaridades entre as concreções da pineal e a dentina, ossos, esmalte ( BOCCHI, G. & VALDRE, G., 1.993), o autor é levado a concluir que as concreções são um produto fisiológico e não patológico. Muitos processos de biomineralização, possivelmente, são engendrados por distrofia celular e produtos de pedaços de membranas, que servem como estrutura para a cristalização (WUTHIER, R. E., 1973; BOSKEY, A. 1.989). A distrofia celular, por outro lado, não é o único mecanismo pelo qual os núcleos de mineração são formados. Este processo pode ocorrer pela interação eletrostática, estrutural e estereoquímica dada uma interface orgânica-inorgânica. Como estudado na natureza a biomineralização lamelar é universalmente observada por deposições episódicas sobre uma matriz polimérica extracelular (freqüentemente fibras colágenas) que servem como faces hidrofóbicas onde proteínas ácidas são agregadas. A mineralização ocorre na interface entre proteínas ácidas e o ambiente aquoso (MANN, S., 1.993). A deposição seqüencial de matéria orgânica e inorgânica cria a aparência de bandas claras e escuras, lamelas ou crescentes. Devido ao fato da mineralização ocorrer por aposição entende-se a sucessão de estágios do globular para as formas em amora. Assim, corroborando esta progressão, observa-se um grande número de formas globulares em espécime de uma amostra de um adolecente de catorze anos com uma mínima quantidade de estratificação e formação ativa de cristais. SCHMID, H.A. & RAYKHTSAUM, G. (1.995) observam que a relação cálcio-fósforo é menor nas camadas intermediárias entre o centro e a periferia. Esta mesma relação é mais elevada em posições que se distanciam do centro, da concreção, e isto pode estar ligado ao fato de que os cristais são construídos dentro de formas supramoleculares das hélices das fibras colágenas e que o crescimento do cristal é anisotrópico. Esta combinação de formas pode resultar num crescimento em espiral. Isto é corroborado pelos achados dos autores em que os núcleos de cristalização ocorrem num centro ao mesmo tempo que a periferia, sugerindo a formação em espiral. Observa-se uma relação maior de cálcio-fósforo em idoso em comparação com espécime jovem. Este dado somado ao fato de que as camadas de uma concreção tornan-se mais estreitas com a idade, sugerem uma repetitiva aposição com um constante remodelar ou reconstrução de todas as camadas. A observação de calcificações precoces em muitas crianças, assim como pouca calcificação em indivíduos velhos como demonstardos por alguns histologistas, como (HEIDEL, G., 1.965; SCHARENBERG, K. & LISS, L., 1.965; WILDI, E. & FRAUNCHINGER, E., 1.965; TAPP, E. & HUXLEY, M., 1.972; GALLIANI, I et al., 1.989) pode ser explicado pelo fato do cálcio contido nas deposições pode aumentar sem se tornar extensivamente visível. SCHMID, H. A. & RAYKHTSAUM ,G. (1.995) enfatizam que não há uma correlação positiva entre envelhecimento e depósito de cálcio na pineal (COMMENTZ, J. C. et al., 1.986; BOJKOWSKY, C. J. & ARENDT, J., 1.990), nem tampouco a relação inversa entre níveis de calcificação e produção de melatonina. A teoria do envelhecimento e falência da pineal está sendo mudada pela observação de pinealócitos obtidos de humanos de todas as idades são capazes de sintetizar melatonina em iguais níveis in vitro, quando apropriado substrato é fornecido. Similarmente estudos pós mortem de pineais humanas não revelam mudanças nas enzimas necessárias para a síntese de melatonina. A mais importante evidência explicativa para a atenuação da produção de melatonina relacionada ao envelhecimentp, diz respeito a alterações ligadas ao avanço da idade, em receptores beta adrenérgicos. O cálcio tem importante papelno metabolismo da melatonina, de tal sorte que distúrbios neste sistema poderiam acarretar a deposição cálcica. Os autores hipnotizam que o pinealócito poderia chegar a uma exaustão (distrofia), de tal modo que a regulação de cálcio poderia se desorganizar, semelhantemente ao que ocorre no envelhecimento celular. Poderia então haver uma precipitação juntamente com ésteres fosfatos sempre presentes nos pinealócitos, comprometendo a biossíntese de melatonina. HUMBERT, W. & PÉVET, P. (1.995) estudaram glândula pineal de ratos envelhecidos, enfocando a localização intracelular de cálcio e a variação do número de pinealócitos. Descrevemos a seguir, alguns aspectos dos resultados obtidos e tópicos importantes discutidos pelos autores. A glândula pineal de ratos é constituída de células parenquimatosas, pinealócitos claros e escuros e células da glia. Os resultados da análise por microscopia eletrônica de transmissão demosntraram um relativo decrécimo de 12% no número de pinealócitos de ratos envelhecidos (células claras e escuras). Uma análise detalhada mostrou um decrécimo de 30% de pinealócitos claros típicos, conhecidos por serem pinealócitos funcionais, assim como um aumento de 140% de pinealócitos escuros observados no grupo de ratos velhos ( 28 meses ) em comparação com o grupo de ratos novos (3 meses). A demonstração da presença de cálcio é feita por método citoquímico. Assim os dois tipos de pinealócitos podem ser distinguidos com base na distribuição e concentração de cálcio. Pinealócitos claros são caracterizados por poucos precepitados, localizados principalmente nas mitocôndrias, na forma de grânulos intramitocondrias. Pinealócitos escuros, ao contrário, são caracterizados por numerosos precipitados, espalhados pelo citoplasma, assim como em mitocôndrias, retículo endoplasmático, grânulos de lipofucsina e concentrados de lipídeos. Partículas eletrodensas formam redes (clusters) na matriz mitocondrial, depósitos intranucleares de cálcio, caracterizando sinais de degeneração dos pinealócitos. A microanálise por raio-x demonstrou que os precipitados, principalmente presente nos pinealócitos escuros, contém cálcio. A presença de cálcio é demonstrada pelo método de potácio-piroantimoniato (KLEIN,C et al., 1.972). O estudo confirma através de microanálise por raio-x, que potássio é substituído por uma forma de complexo cálcio-piroantimoniato (TANDLER, C. J. et al, 1.970; SIMSON, I. A. V. & SPICER, S. S., 1.975; CHANDLER, J. A., 1.977; BOWEN, I. D. & RYDER, T. A., 1.978). Assim com os resultados microanalíticos obtidos, os autores consideraram que os precipitados encontrados no tecido pineal eram de cálcio-antimoniato, indicando alta probabilidade de localização intracelular do cálcio. Precipitados de antimoniatos tem sido descritos em pinealócitos escuros, especialmente em mitocôndrias degeneradas, dropletes de lipídeos, lipopigmentos, e concreções em crescimento, enquanto são menos freqüentes em pinealócitos claros, onde os precipitados localizam-se nas membranas celulares, como descrito acima. A presença de concreções em pinealócitos escuros fala a favor da formação de concreções a partir destes, numa ambiência rica em cálcio. A evidência que há pouco precipitado de antimoniato em pinealócitos claros em comparação aos escuros (PIZARRO, M. D. L. et al., 1.989), fala a favor de que a membrana celular se torna enfraquecida, permitindo uma entrada em larga monta de cálcio na célula. Vesículas ricas em cálcio e vacúolos derivados de mitocôndrias presentes quase que exclusivamente durante a fase escura parecem ser sítios primários de mineralização, enquanto que a localização citoplasmática do cálcio ocorre somente durante a fase clara. Os autores analisando pineal de ratos em ultraestrutura e microanálise, procuram entender o processo de biogênese das concreções. Os autores colocam, na introdução do trabalho, que as concreções calcáreas em mamíferos são especialmente encontradas em gerbil e humanos. Segundo os autores, ainda que a via intracelular seja o modo clássico de biomineralização, a rota extracelular parece ser uma via alternativa. HUMBERT, W. & PÉVET, P. (1.995) referem que, de acordo com seus resultados, nos estudos em ratos, que material resultante da degeneração celular e produtos secretórios proteináceos podem iniciar a formação de concreções pelo fato das mitocôndrias e retículo endoplasmático estarem sendo considerados sítios da regulação de cálcio, devido a grande concentração de cálcio e fósforo presentes na mitocôndria durante a mineralização (WALZ, B., 1.982; SOMLYO, A. P., 1.984; ALBERTS, B. et al., 1.983). Consideram assim, a possibilidade de ser esta primeira fase da formação de hidroxiapatita. Também os autores observaram vesículas e vacúolos originados do retículo endoplasmático, as quais têm a mesma capacidade de concentrar cálcio e fósforo, evidenciando por microanálise por raio-x. Afirmam portanto que o retículo endoplasmático tem também importante função na gênese das concreções. Igualmente, fibras colágenas podem servir de sítios de precipitação de cristais de hidroxiapatita e portanto iniciadores de mineralização. WUTHIER, R. E. (1.973) em importante revisão coloca que há duas escolas de pensamento estudando como o processo de mineralização é induzido durante a calcificação de tecidos. Há uma visão que a mineralização é iniciada por núcleos heterogêneos de colágeno, isoladamente como nos estudos dos autores GLINCHER, M. J. ( 1.959); GLINCHER, M.J. & KRANE, S. M. (1.968); NEUMAN, W.F. (1980, ou em combinação com várias proteínas com as quaisno colágeno se associa conforme estudaram os pesquisadores ANDREWS, A.T. et al. (1.967); HAUSCHKA, P.V. et al. (1.975); LINDE, A. et al. (1.981). Há também a visão de que a mineralização é um processo diretamente mediado por células no qual as mitocôndrias e vesículas matriciais servem como sítios do processo de calcificação. Estudaram as mitocôdrias nesse processo os pesquisadores BRIGHTON, C.T. & HUNT, R.M. ( 1.976, 1.978) MARTIN, J.H. & MATTHEWS, J.L. (1.970, 1.971); SHAPIRO, I.M. & GREESPAN, J.S. (1.969), e as visículas matriciais ( ANDERSON, H.C., 1.969; BAB, I. et al., 1.979; BERNARD, G.W., 1.972; SAYEGH, F.S. et al, 1.974). CIPOLLA NETO, J. (1996) estudando o metabolismo da pineal em roedores resalta o envolvimento de influxo intracelular de cálcio. O autor afirma que a ativação dos receptores alfa 1, em ratos, promove um aumento do cálcio intracelular, dependente tanto de um aumento do influxo de cálcio, quanto da liberação de cálcio de estoques intracelulares. Há dados mostrando um papel potenciador do complexo cálcio - calmodulina na ativação da enzima adenilatociclase, fato que poderia estar ocorrendo também na glândula pineal. O cálcio parece exercer um papel importante nos processos de transcrição e tradução gênicas e síntese da própria Nacetiltransferase. ARENDT, J. (1.995) explica que o primeiro passo para a formação da melatonina é o aporte de triptofano da dieta. A absorção de triptofano pelo cérebro é dependente dos mecanismos de transporte através da barreira hemato-encefálica. O triptofano é transformado em 5- hidroxitriptofano pela triptofano-5-hidroxilase, uma enzima mitocondrial. Ocorre a descarboxilação do 5-hidroxitriptofano, originando a serotonina, pela enzima citoplasmática aminoácido descarboxilase aromático. Esta enzima é largamente distribuída nos tecidos e é essencial para a síntese de neurotransmissores catecolamínicos. A enzima N-acetil transferase (NAT) promove a N-acetilação da serotonina. A NAT está presente no citoplasma do penealócito e também na retina (arilalquilamina N- acetil transferase), Apresentando propriedades específicas, distintas de sua atuação em outros tecidos. O passo final é a O-metilação da N-acetil serotonina, pela hidroxiindol-O-metiltransferase (HIOMT), originando a melatonina. A variação da serotonina na pineal durante o dia, assim como os níveis de HIONT demostram a primeira evidência da atividade rítmica metabólica da pineal, com incremento da atividade desta enzima no período da noite e supressão durante o dia. Estes fatores fundamentam o conceito de que a pineal é um transdutor fotoneuroendócrino. YAMADA, N. et al. (1.996) estudaram radiológicamente calcificações cerebrais através de ressonância nuclear magnética, utilizando GRE (gradient-recalled echo). O objetivo era promover um modelo para diferenciação radiológica entre hematomas e calcificações cerebrais. Assim, detectou em 13 pacientes com calcificações em pineal e plexo corióide (dentre outros resultados referentes a outras áreas cerebrais, em mais ampla casuística), que estas calcificações têm características diamagnéticas mais acentuadas que a água e o tecido cerebral. Estas características ligadas a campos magnéticos foram estudadas por SEMM,P. et al.(1.980), no que diz respeito aos efeitos do campo magnético terrestre e a atividade elétrica de células da glândula pineal. Os pesquisadores concluem que a atividade é deprimida pela aplicação de uma força magnética, e restaurada quando a força é revertida. Observam também que outras estruturas cerebrais(coliculos superior e inferior, corpo caloso e epitálamo) em idênticas condições experimentais, não tiveram reação alguma à aplicação de força magnética, em experiências realizadas em guinea pig. Ressaltam ainda que o sistema nervoso simpático também sofrem influências de campos magnéticos, assim o efeito na pineal poderia ser indireto. REITER, R. J. (1.991) em interessante estudo sobre o assunto, conclui que campos magnéticos e elétricos alteram o metabolismo de indolamina na pineal, mas tais alterações também poderiam vir por vias indiretas. A glândula pineal e seu principal hormônio, a melatonina, implicando na regulação dos ciclos biológicos, tem importância fundamental em medicina, seja na compreensão da ritmicidade de atuação de medicamentos no organismo, os ciclos hormonais e as alterações, psiquiátricas decorrentes de distúrbios dos ritmos biológicos, como a insônia e a depressão. Em interessante estudo de 26 casos de pacientes com síndrome de Down, por ARAI, Y. et al. (1.995), procura-se ligar a presença de calcificações intracranianas(inclusive pineal e plexo coróide) com sintoma de envelhecimento. SANDYK,R. (1.993) busca relacionar calcificação da pineal e esquisofrenia crônica. Seus achados sugerem que tanto danos diencefálicos como calcificação da glândula pineal podem estar relacionados com desorganização do pensamento na esquisofrenia, assim como com um prognóstico desfavorável.

Métodos Anatómicos de Estudo da Pineal
BINKLEY, S. (1.998) ressalta que a pineal pode ser estudada pela microscopia de luz utilizando técnicas histológicas convencionais. Após preparo e fixação em formalina, solução de Boin ouglutaraldeido; em bebição em parafina, secção com micrótomo ou ultramicrótomo e coloração, por exemplo, com hematoxilina-eosina. Muitas pineais são pequenas e requerem algumas mudanças técnicas no preparo. Também as concreções podem dificultar os cortes ao micrótomo. Quanto a microscopia eletrônica BINKLEY, S. (1.988) ressalta a importância da varredura na análise da anatomia da superfície, estuda da vasculatura e concreções da glândula pineal. GOLDSTEIN, J. I. explicam que além da possibilidade da análise tridimensional, com efeitos de contrastes dados por elétrons secundários ou retroespalhados, a microscopia eletrônica de varredura pode estar acoplada ao espectômetro de raio-x por dispersão de energia (EDS), possibilitando a microanálise quantitativa de elementos minerais, como é o caso das concreções da pineal. Estes estudos nos induzem à necessidade de pesquisas, dada as possibilidades de aplicação médica, para uma melhor compreensão do padrão evolutivo da formação das concreções, o envolvimento celular, localização das concreções na pineal, natureza químico e estrutural e estudo do padrão de cristalinidade do material, na glândula pineal humana.

PROPOSIÇÃO
Em face dos dados encontrados na literatura consultada, propomos analisar:
1- Os aspectos histológicos do corpo pineal empregando a coloração de hematoxilina - eosina.
2- Os aspectos tridimensionais do corpo pineal empregando vários métodos em microscopia eletrônica de varredura.
3- Os aspectos obtidos em microscopia da varredura por emissão de raio-x e difração de raio-x
 

MATERIAL E MÉTODOS
O material consiste de 8 pineais de cadáveres humanos coletadas junto ao Serviço de Verificação de Óbito da Faculdade de Medicina da USP. Este material foi distribuído da seguinte forma: 2 pineais humanas sem identificação foram utilizadas em microscopia de luz; 2 pineais para microscopia eletrônica de varredura, sendo que a segunda amostra é de cadáver humano com idade de 61 anos, masculino, branco, com causa mortis por tromboembolismo pulmonar tendo como patologia de base neoplasia de pulmão ( foi utilizado também o plexo corióide adjacente a esta glândula, para microscopia eletrônica de varredura); 2 pineais para EDS, sendo a primeira de cadáver humano com idade de 80 anos, feminino, branco, com a causa mortis de infarto agudo do miocárdio e a segunda com idade de 59 anos, feminino, parda, com causa mortis por insuficiência respiratória; 2 pineais para difração de raio-x, a primeira correspondente a 31 anos, masculino, branco, com causa mortis de infarto hemorrágico do tronco cerebral, tendo como patologia de base hipertensão arterial sistêmica, sendo a segunda amostra de 28 anos, masculino, sem especificação de cor, com causa mortis de infarto agudo do miocárdio.
 

1 - MICROSCOPIA DE LUZ: Após a retirada do encéfalo 2 glândulas pineais foram coletadas e fixadas em solução de formalina a 10% por período de 48 horas. Em seguida as peças foram lavadas em água corrente, desidratadas em série crescente de álcoois e submetidas a tratamento de rotina para inclusão em parafina e realização dos cortes histológicos. Foram realizados cortes de 07 mm que foram corados pelo método de Hematoxilina-Eosina. As lãminas foram observadas em microscópio Olympus do departamento de Anatomia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. As lâminas selecionadas para a documentação foram fotografadas em fotomicroscópio Zeiss do Departamento de Anatomia do ICB/USP.

2 - MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA Após a retirada do encéfalo, 2 glândulas pineais foram coletadas e fixadas em solução de Karnovsky modificada, durante 24 horas. Após esta fase o material foi lavado em solução tampão fosfato de sódio, 0,1M (ph 7,2) sendo colocado posteriormente em solução de ácido tânico 2% durante 2 horas a temperatura ambiente. Em seguida o material foi lavado em solução tampão fosfato de sódio 0,1M (ph 7,2) e pós fixado em tetróxido de ósmio durante 2 horas a 4 oC. A desidratação foi realizada em série ascendente de álcois e a secagem foi feita em aparelho de ponto crítico Balzers, CPD-030, utilizando CO2 líquido. As peças foram montadas em bases metálicas e cobertas com ouro em aparelho de Íon Sputter Balzer - SCD - 040 e posteriormente analisadas em microscópio eletrônico de varredura Jeol, JSM-6100 do ICB-USP. Parte do material, após fixação, foicolocado em nitrogênio líquido e fraturado para evidenciação das concreções calcáreas. Em seguida foi empregada a mesma metodologia acima mencionada para observação ao microscópio eletrônico de Varredura.

3 - MICROANÁLISE E DIFRAÇÃO DE RAIO-X Para análise dos cristais 2 glândulas pineais foram digeridas em solução de NaOH a 10% durante 24 horas. Em seguida o material foi lavado em água destilada durante 72 horas para completa liberação das concreções. Após o isolamento dos cristais, os mesmos passaram por um processo de secagem à temperatura ambiente. Para o preparo das concreções, para visualização e microanálise ao microscópio de varredura por espectroscopia de raio-x, foi providenciado o polimento do material, realizado por equipe técnica da Faculdade de Geologia da USP. A seção polida consistiu de impregnação do material em resina epox com posterior polimento do mesmo com pastas de diamante em quatro seções. A primeira com pasta de partículas de diamante com 15 micrômetros de diâmetro. Depois progressivamente com pastas mais finas até partículas de diamante com 1 micrômetro de diâmetro. As concreções polidas são analisadas em dois aparelhos acoplados:
a. Microscópio Eletrônico de Varredura por Elétrons Retroespalhados - Microscópio marca Leica - modelo S 440 do Laboratório de Tecnologia da Escola Politécnica da USP - Engenharia de Minas. Para esta análise as lâminas com cristais polidos são recobertas com finas camadas de carbono, por evaporação de carbono.
b. Microanálise - Espectrômetro de Raio-X por dispersão de energia (EDS). Este aparelho é acoplado ao Microscópio Eletrônico de Varredura por Elétrons Retroespelhados permitindo a análise da composição química do material. Para estuda da cristalinidade do material assim como a caracterização do material, foi utilizado um Difratômetro de Raio-X Marca Phillips MPD 1880 - PW 1710 com tubo de cobre (gerador de Raio-X). O material foi prensado com êmbolo manual para minimizar problemas de orientação preferencial, permitindo com que os planos dos cristais fiquem aleatórios, utilizando a fidelidade dos resultados. A amostra, para este procedimento, foi montada sobre uma lâmina de vidro circular com 2,5 cm de diâmetro e fixada com cola de estrutura amorfa (não interfere nos resultados da difração).

RESULTADOS
Os resultados obtidos na presente investigação estão divididos em três partes:
1 - Microscopia de luz Na análise das lâminas histológicas verifica-se a estrutura da glândula pineal constituída por um parênquima celular associado a trabéculas contendo fibras conjuntivas (Fig.1). Nota-se a distribuição de grânulos de maior densidade e de coloração mais intensa que correspondem às concreções calcáreas de formas circulares e em mórula (Fig. 2).